Обычно в центрифужной пробирке над осадком оставляют некоторое количество жидкости и дают возможность немного ей постоять. Жидкостью, содержащей большое число трепонем, заражают кроликов для следующей постановки реакции. При каждой постановке следует одновременно производить и заражение. Зараженных кроликов содержат в клетках в проветриваемом помещении при температуре +18…20°С. Пища кроликов должна содержать значительное количество витаминов.
Для сохранения трепонем жизнеспособными предложено большое количество различных сред (Овчинников Н. М., 1961).
Первоначально среда Нельсона была очень сложна. Затем Нельсон значительно упростил ее, но она все еще сложна. A. Bellone и М. Bonelli (1957) в качестве среды для сохранения трепонем применяют разведенную изотоническим раствором натрия хлорида сыворотку человека (2:1), а К. Meinike и К. Lagel (1959) – сыворотку кролика (2:1 или 1:1). Следует отметить, что трепонемы, взвешенные в одном изотоническом растворе натрия хлорида и особенно вместе с сывороткой больного и комплементом в небольшой дозе, выживают, судя по контрольным исследованиям, и без какой-либо среды, однако сроки их выживания значительно короче, подвижность менее активна, и наблюдается значительное количество сомнительных результатов.
Н.М. Овчинников (1961, 1962) предложил для РИБТ простую среду. Готовят 0,2% раствор пищевого желатина на 0,83 % растворе натрия хлорида. Раствор стерилизуют автоклавированием при температуре 110°С в течение 10 мин, после чего добавляют стрептомицина сульфат из расчета 1:10000. Среда для опыта состоит из сыворотки кролика, разведенной 1:2 изотоническим раствором натрия хлорида, желатина и раствора человеческого альбумина. Альбумин готовят на изотоническом растворе натрия хлорида, стерилизуют фильтрацией через бактериальный фильтр (пригоден только сухой альбумин, лиофильно высушенный); каждый раз при употреблении новой серии следует испытать, параллельно со старой, новую серию. Весь запас ингредиентов хранится в обычном рефрижераторе.
На 10 сывороток требуется 1,2 мл 0,2 % раствора желатина, 2,8 мл 5 % раствора альбумина и 1,6 мл взвеси трепонем. Вымывание трепонем обычно производят разведенной кроличьей сывороткой, но можно с самого начала использовать указанную среду сохранения. Особенно следует обращать внимание на возможность у кроликов спонтанного спирохетоза, при котором могут наблюдаться положительные результаты реакции или спонтанная агглютинация трепонем.
При хранении ингредиентов рН среды может меняться. В случае окисления среды к ней следует добавить 1 % стерильный раствор натрия гидрокарбоната до рН 7,2.
Реакция протекает только при условии избытка комплемента, поэтому применяют различные количества комплемента, что в значительной степени зависит от примененной среды. При пользовании одной и той же средой установлено, что чем больше взято комплемента, тем больше находят иммобилизованных трепонем, а чем меньше комплемента, тем больше подвижных трепонем. При употреблении желатиновой среды оптимальное количество комплемента равно 0,15 мл на каждую пробирку. Комплемент применяется свежий, полученный от морской свинки. Консервированный комплемент непригоден.
